仿贻贝水凝胶在组织愈合中的应用研究

目前外科手术中组织损伤的常规修复方法是手术线缝合、订皮钉固定, 但是对于相对脆弱的器官、软组织存在的缝合渗血或无法缝合等临床问题仍有一定的应用局限性.医用粘合剂包括组织粘附剂、止血剂、密封剂, 可满足不同手术部位的医用需求, 在临床操作中成为新的伤口闭合方法, 具有止血迅速、感染率低、无需拆线、术后瘢痕小等优点[1, 2].目前, 化学类医用粘合剂主要有α-氰基丙烯酸酯类, 具有极高的组织粘附性, 但是降解产物的毒性限制了其在体内组织损伤的应用[2, 3].纤维蛋白原作为一种生物医用粘合剂主要作用是止血, 通过与机体凝血系统相互作用产生凝血效果, 同时还能黏附于创面发挥物理止血作用, 但是具有诱发机体免疫反应等安全性问题[2, 3].另外由于伤口周围较多的体液和血液, 目前的医用粘合剂在湿润环境下的粘附力和生物相容性仍需优化和提高[3], 因此“理想”的生物粘合剂仍是研究的热点和难点.

在自然界中, 贻贝、藤壶、管虫等海洋生物具有很好的水下附着力[4, 5].其中贻贝分泌的足丝蛋白在水中具有快速的固化速度、高强的防水粘附能力以及优异的粘附多样性, 使其成为极具优势和潜力的生物粘合剂[6, 7].贻贝足丝蛋白中含量丰富的多酚化合物3, 4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)对湿态粘附及粘附多元化起到了关键性作用[7].因此, 近年来受贻贝启发的多酚类仿生材料受到越来越广泛的关注[8~12].多酚化合物含有大量的邻苯二酚或邻苯三酚基团, 具有以下特点: (1)粘附性:多酚官能团不仅可以参与形成多种非共价键作用力(如氢键、π-π堆积、阳离子-π作用及与金属氧化物的配位作用), 而且多酚化合物容易被氧化为醌式结构, 与组织蛋白中的氨基或巯基发生Schiff碱反应或者Michael加成反应, 也可以与金属离子(如Fe3+)发生配位螯合反应, 与硼酸基团形成动态硼酯键, 自身还可发生歧化反应产生偶联来增加粘附强度(图 1)[13~15]; (2)止血性:多酚类物质可以与血液中蛋白质和多糖的活性残基发生反应, 导致血液快速凝固, 另外多酚结构中大量的负电荷也能够激活机体中的凝血因子XII进而引发自身的凝血级联反应提高其止血能力, 是一类新型的止血剂[16~18]; (3)抑菌性:多酚与蛋白质高度的结合能力, 使细菌无法正常生长, 从而起到抑菌功能, 可以保护创面不受细菌侵害[13, 19, 20].因此仿贻贝多酚材料是集粘附性、止血性、抑菌性于一体的多功能医用粘合剂.

目前, 仿贻贝多酚类的水凝胶、纳米颗粒和薄膜被广泛设计开发并进入临床试验阶段[8, 21, 22].其中, 仿贻贝水凝胶是兼具粘附力与内聚力的软物质, 不仅可以实现伤口处的原位自组装和可控降解、适应伤口的尺寸与形状、提供伤口愈合所需的润湿环境; 也可作为防护性的物理屏障, 阻止外源微生物的入侵, 促进创面组织愈合[1, 23].在伤口闭合和组织再生方面与现有的缝合等侵入式伤口闭合技术相比体现了其卓越的优势[23].目前多酚功能化的组织粘附水凝胶主要有多酚-合成高分子水凝胶、多酚-生物大分子水凝胶、多酚-无机纳米材料复合水凝胶以及聚多巴胺纳米颗粒复合水凝胶.本文主要概述仿贻贝多酚凝胶在组织止血、粘附、抑菌等伤口处理方面的应用及最新进展, 总结归纳了多酚凝胶作为医用粘合剂仍需解决的关键科学问题和存在的实际应用问题, 并对未来的研究方向进行了展望.

目前制备刷型或线性仿贻贝聚合物的主要方法是将DOPA、多巴胺(DA)、3, 4-二羟基苯基丙酸等小分子多酚偶联到聚合物骨架的末端或侧链上, 或者引发乙烯基功能化儿茶酚单体发生自由基聚合[23~25].而聚合物骨架主要有聚丙烯酰胺(PAAm)[26]、聚丙烯酸酯[10]、聚乙二醇(PEG)[27]、聚丙烯胺[28]、聚苯乙烯[29]等, 不同的高分子链骨架赋予材料各种优异性能[30].

邻苯二酚基团修饰的聚乙二醇具有良好的生物相容性和防污性能, 在组织粘附、抗菌涂层方面具有潜在应用(图 2a). 2002年, Messersmith课题组[27, 31]将DOPA接枝到直链PEG、多臂PEG以及PEG嵌段共聚物中, 在辣根过氧化酶/过氧化氢(HRP/H2O2)、高碘酸钠(NaIO4)、氧气(O2)等氧化剂的作用下催化交联形成凝胶且在潮湿环境中具有较高的粘附性.其中, 负载NaIO4的脂质体与DA修饰的四臂PEG混合形成温敏水凝胶, 组织粘附强度比纤维蛋白胶的粘附强度高约5倍[32], 并在羊胎膜修复和小鼠胰岛移植试验中表现高效的粘附与密封作用[33, 34].然而, PEG基材料的生物降解性较差, 因此利用丙氨酸-丙氨酸(Ala-Ala)二肽或柠檬酸(CA)通过酯化反应连接PEG和DA可以提高凝胶的酶解性能[35, 36].后者得到的iCMBA (injectable citrate-based mussel-inspired bioadhesives)聚合物氧化交联形成可降解水凝胶, 粘附强度高达(123.23±13.23) kPa, 可促进创面止血愈合且无明显炎症反应(图 2b)[35].

多酚还可以与金属离子形成pH响应的可逆动态配位键, 实现水凝胶的自修复功能[14, 37].利用Fe3+交联多臂PEG-DA制备具有自愈合性能的粘附水凝胶, 并通过调控pH实现由低粘度流体到稳定凝胶的转变, 并在干燥和润湿环境下均具有粘附性[38].除此之外, 硼酸基团与邻苯酚形成可逆硼酯键同样赋予凝胶自愈合性能.多臂PEG-DA与1, 3-苯二硼酸在pH＝9时形成硼酯键交联的水凝胶, 能在30 s内无缝愈合, 当调整pH＝3时水凝胶恢复起初的粘液状态, 并且过程可逆[39].

单宁酸(tannic acid, TA, pKa≈8.5)是一类天然植物多酚, 具有抗氧化、抑菌等生物活性[40~42].结构中含有大量邻苯三酚(没食子酰基)以及邻苯二酚(儿茶酚)基团(图 3a), 酚羟基作为氢键供体具有较强形成氢键的能力[43].因此TA常作为“分子交联剂”与合成高分子, 如PEG[44]、聚乙烯醇(PPA)[45]、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)[46]、聚吡咯(PPy)[47], 聚苯乙烯磺酸钠(PSS)[48]、聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)[49]等形成分子间氢键、亲疏水作用、静电作用和π-π堆叠等非共价键相互作用力, 诱导形成凝胶或者聚集体(图 3b).另一方面, TA可以与高分子链上的官能团(例如氨基、巯基)自发形成共价键, 并进一步与金属离子或者苯硼酸类化合物形成动态化学键来构筑具有粘附性能的水凝胶[28, 46, 50].此外, 利用三羟甲基丙烷缩水甘油醚交联TA制备的水凝胶具有生物可降解性, 并对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、革兰氏阴性铜绿假单胞菌和白色念珠菌均表现出较强的抑制作用, 作为抑菌伤口敷料具有潜在的应用价值[51, 52].

合成高分子水凝胶具有优良的力学性能, 但作为生物材料常缺乏生物降解性.多糖、蛋白质、多肽等生物大分子含有大量利于化学修饰的活性基团, 通过多酚修饰制备生物粘合剂材料不仅保持生物大分子的活性, 还可赋予其粘附性以及止血抑菌性能.

多糖基水凝胶易降解、力学性能差, 而多酚修饰的多糖化合物如海藻酸盐[53]、纤维素[54]、壳聚糖[55]、透明质酸钠[44]和硫酸软骨素[56]等在一定程度上改善了多糖水凝胶的力学性能, 常作为伤口敷料来促进组织愈合.壳聚糖作为一种常用的生物大分子多糖, 具有良好的抑菌性和止血性能, 但组织粘附性和溶解性较差[55, 57].壳聚糖链段中阳离子氨基与邻苯二酚存在协同粘附作用, 因此Lee课题组[58]利用邻苯二酚基团接枝壳聚糖制备了复合物CHI-C (catechol-modified chitosan), 其溶解性和粘附性显著提高, 而且CHI-C与巯基化的Pluronic高分子通过端基的迈克尔加成交联形成温敏凝胶, 该水凝胶的粘附强度为(7.18±0.93) kPa, 具有明显的止血能力(图 4a, 4b).最近, 该课题组[59]将CHI-C涂敷于注射针表面并诱导CHI-C部分交联, 该注射针在穿刺组织过程中通过原位固体-胶体的转变实现穿刺伤口的自密封(图 4d).使用止血注射针在老鼠尾静脉和兔耳静脉注射后发现能够很好地阻止出血, 并且在血友病老鼠颈静脉穿刺注射之后老鼠的存活率达到100%[59].利用相同的方法开发的止血棉签在正常出血模型和糖尿病出血模型中同样具有良好的止血性能(图 4c)[60].止血剂CHI-C具有良好的生物相容性和组织粘附性且制备简单, 具有临床应用转化的潜力[29].

基于蛋白质(牛血清白蛋白[61]、胶原[62]、明胶[63]、凝血酶[16])、多肽[64~66]、DNA[67]等一系列生物大分子的多酚凝胶体系也已经被开发设计.王东安课题组[61]以牛血清白蛋白(BSA)、CA和DA为原料制备了具有组织相容性的新型组织胶(BCD组织胶).在湿态环境中, BCD组织胶的粘附强度相当于纤维蛋白胶粘附强度的10倍.在小鼠肝脏损伤止血实验中, 未处理组的小鼠流血量是BCD组织胶处理组的25倍, BCD组织胶表现出了优异的止血能力.徐虹、迟波课题组[65]利用肽基ε-聚赖氨酸(PLL)模拟贻贝粘合蛋白的骨架结构, DA模拟蛋白粘附的主要贡献成分DOPA, 得到了与天然贻贝足丝蛋白组分接近的DA-PLL聚合物, 通过HRP/H2O2原位催化得到可注射的PPD (PLL-PEG modified with DA)水凝胶(图 5).聚合物中邻近的赖氨酸-邻苯二酚仿生结构分布产生的“协同粘合效应”赋予水凝胶材料在生理条件下高强度的湿态组织粘合强度(约147 kPa)和伤口封堵止血能力.同时水凝胶具有优异的体外抗菌和体内抗感染能力, 大鼠皮肤创面缺损修复实验显示该水凝胶促进创面高效修复愈合且无炎症和异物反应[65]. DA修饰的聚谷氨酸在HRP/H2O2条件下得到凝胶的组织粘附强度达30 kPa, 同样具有止血、抑菌能力, 且无毒副反应[66].

将无机纳米粒子或者具有纳米结构的材料通过物理作用或者化学反应均匀地分散到聚合物网络中, 可以构筑兼具凝胶材料独特的流变学特性以及纳米材料功能性的复合水凝胶, 这为优化和设计新型智能软材料提供了更为简便的方法[68~70].已报道的纳米材料主要有氧化石墨烯、碳纳米管、二维纳米粘土(clay)、羟基磷灰石纳米颗粒、二氧化硅、金属/金属氧化物纳米颗粒等[68, 69, 71].

邻苯酚结构在强氧化剂作用下形成高活性的醌结构, 促使分子间共价交联, 导致不可逆的快速固化, 因此强氧化剂介导下多酚水凝胶的粘附性往往不具有重复性, 且粘附强度取决于氧化剂对酚羟基的氧化程度.为此鲁雄课题组[72]利用纳米粘土模拟海水环境, DA插入二维层状纳米粘土的层间形成纳米聚集体, 与丙烯酰胺单体原位交联形成超强PDA-clay-PAM水凝胶.在纳米粘土层之间的纳米空间中氧化的PDA链保持足够的儿茶酚基团, 使水凝胶的粘附性长期存在, 对比于传统的一次性粘附水凝胶, 该水凝胶具有可重复使用性和耐用性, 即使在长期储存条件下粘附性仍然存在. PDA-clay-PAM水凝胶不仅能够粘附在人体皮肤表面, 而且对皮肤无刺激、容易剥离, 剥离过程中不会引起皮肤的任何伤害或疼痛(图 6).体外细胞实验表明水凝胶具有良好的细胞亲和性, 能够促进细胞粘附和增殖, 体内动物皮肤缺损实验显示水凝胶能够促进皮肤组织的再生[72].

Lee课题组利用生物相容性的硅酸镁锂(Laponite)分别交联DA-PAAm[73]和DA-PEG[74]得到了纳米复合水凝胶, 邻苯二酚与硅酸镁锂之间的物理作用力可耗散能量提高凝胶的强度和韧性.其中, Laponite/DA-PEG水凝胶具有很好的塑形性, 可根据伤口需要设计不同形状, 随着时间的延长, 凝胶中的多巴胺部分会形成共价的交联结构, 从而使组织封闭剂的形状固定下来, 有利于促进不规则伤口愈合.但是当凝胶混合时间超过30 h后, 由于共价交联程度提高, 凝胶的破裂压力与粘合能力大幅下降, 这也许是因为多巴胺氧化自交联失去了与组织中蛋白质反应的活性[74].

类黑色素聚多巴胺纳米颗粒(Polydopamine nanoparticles, PDA-NPs)具有很好的粘附性、抗氧化性、光热转换性、较高的载药能力、生物相容性等优良性能, 在疾病诊疗领域应用广泛[9, 12, 75].将PDA-NPs引入凝胶体系中, 不仅能赋予凝胶纳米颗粒的功能性, 表面丰富的活性官能团亦可作为交联剂, 提高凝胶的机械性能[76, 77].含有PDA-NPs的复合水凝胶主要有PDA-NPs/ PEG水凝胶[76, 78]、PDA-NPs/PNIPAM水凝胶[79]、PDA- NPs/胶原水凝胶[80]、PDA-NPs/壳聚糖水凝胶[81, 82]等, 在皮肤修复、肿瘤治疗、抑菌等方面效果优异.将PDA-NPs与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体原位聚合可以形成PDA-NPs/PNIPAM水凝胶(图 7). PDA-NPs的光热转换性质促使水凝胶在近红外光刺激下能够产生多重响应, 包括控制药物释放、近红外驱动、近红外辅助愈合.在凝胶表面形成PDA-NPs涂层, 丰富的儿茶酚基团赋予凝胶良好的组织黏附性, 猪皮粘附强度可达90 kPa.体内全皮缺损实验表明, 凝胶与包裹的生长因子具有协同促进皮肤缺损修复的能力[79].

氧化石墨烯(GOx)表面带有丰富的亲水基团, 如羧基、羟基等, 具有良好的生物相容性和易于表面功能化等特点, 近年来在生物医学领域应用广泛[83].在不同的凝胶网络结构中, 利用聚多巴胺部分还原GOx, 可以制备可导电、可拉伸、自粘附和自修复的水凝胶[81, 83, 84]. PDA-GOx复合物在水凝胶中既充当导电成分, 又扮演纳米增强剂的角色, 因此在赋予水凝胶优良导电性的同时也提高了水凝胶的力学性能, 使其具有超高的拉伸性能. PDA-GOx-壳聚糖-蚕丝蛋白水凝胶是一类具有良好机械性能、导电性和抗氧化性能的伤口敷料(图 8)[81]. PDA-GOx复合物不仅可以作为抗氧化剂清除氧自由基(ROS), 减轻伤口部位因过度氧化引起的愈合障碍, 而且其良好的导电性还可以增加细胞间信号的传递, 有利于细胞增殖, 促进伤口再生[81].

传统医用粘合剂具有粘附、止血、抑菌的作用, 但不能促进细胞再生, 伤口容易形成凹陷的疤痕, 愈合时间较长.仿贻贝多酚凝胶可负载生长因子或者治疗剂等生物活性分子, 引导和刺激组织的稳定持续生长.例如设计制备的PDA-NPs/PNIPAM水凝胶封装表皮生长因子(EGF)用于组织损伤修复.小鼠皮肤损伤实验表明含EGF水凝胶处理的伤口被完全修复且被新生皮肤组织和毛发覆盖, 再生组织中形成了更成熟和紧密的胶原纤维且与水凝胶之间无明显界面[79].

水凝胶作为通用型载体缓释平台, 还可以加入具有治疗效果的纳米颗粒, 实现粘附止血和给药治疗的双重目的, 扩展多酚水凝胶的应用范围.新型药物递送系统结合两者的优势, 具有较好的发展潜力.例如将负载CD47抗体抑制剂的CaCO3纳米颗粒包封于粘附性水凝胶中, 在恶性肿瘤手术切除后喷涂该水凝胶, 利用水凝胶的止血性能降低残存肿瘤细胞进入血液循环系统的风险, 并且释放纳米颗粒进行肿瘤免疫治疗[85].但是如何实现多酚凝胶在不同的阶段对活性成分的序列控释来促进皮肤组织再生将是发展功能性生物粘合剂所面临的挑战.而且, 疾病治疗与组织愈合再生一体化也是药物载体研究的热点.

目前医用粘合剂以及传统组织愈合方法多数只针对外科组织损伤的愈合, 而对于自身免疫疾病诱导的组织缺损修复, 例如红斑狼疮, 以及严重感染条件下的组织抑菌、再生修复的创面敷料也是必要的研究方向.另外, 通过调控凝胶的形态与基材的物理化学性能, 满足不同形貌创面所需的使用方式(例如可注射、可喷涂、凝胶贴剂等), 实现在不同环境中的应用也是未来的发展方向之一.

与传统的粘合剂剂相比, 仿贻贝多酚类水凝胶克服了合成类粘合剂化学毒性、固化放热等缺点, 弥补了纤维蛋白胶生物相容性差、粘合强度小等不足, 在伤口愈合、组织修复、抗菌、止血等方面具有较大的应用潜力, 是一种极具研究价值和应用前景的绿色材料.但是如何找到材料内聚力与界面粘接力之间最佳的平衡点, 仍是发展高防水性、多功能的生物粘合剂的重要科学问题.多酚水凝胶的粘附性受体系中自由的酚羟基含量影响明显, 酚羟基的氧化会引起粘附能力的下降, 在实际应用中应考虑粘合剂的长期稳定性、氧化引起颜色和粘附强度变化等关键问题, 建立结构-组成-性能之间的构效关系对于指导制备高强度多酚粘合剂具有重要的意义.随着科技的日趋发展, 多酚凝胶作为集粘附剂、止血剂与抑菌剂于一体的组织粘合剂, 在生物医学领域将会得到更多的改良和发展, 并将实现医用粘合剂向给药控释或疾病诊疗等多功能一体化方向发展.